張家慶¹，王璟¹，陳俊峰¹，任巧玲¹,高彬文¹，馬強¹，郭紅霞¹，白獻曉¹，熊少偉²，梁永紅¹，邢寶松[1]^*  

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；2. 河南興銳農(nóng)牧科技有限公司,河南 信陽 465550）

摘要：為更有效地保護和高效利用現(xiàn)有地方良種資源，充分挖掘其優(yōu)異基因為育種和生產(chǎn)服務(wù)，對現(xiàn)有淮南豬種質(zhì)資源進行親緣關(guān)系研究具有重要的理論和實際意義。本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，采用國際動物遺傳學(xué)會( ISAG) 和聯(lián)合國糧農(nóng)組織( FAO) 共同推薦的21個微衛(wèi)星標(biāo)記，對現(xiàn)有淮南公豬的基因組DNA進行了檢測，通過計算等位基因數(shù)量、基因頻率、親緣關(guān)系、遺傳距離等參數(shù)，對其遺傳多樣性的現(xiàn)狀進行了初步分析。結(jié)果表明：在 21個微衛(wèi)星基因座上共檢測到 93個等位基因，21個位點的等位基因數(shù)為3-8個，平均等位基因數(shù)為4.43個；公豬個體間的親緣關(guān)系清晰可見，在系數(shù)為0.748水平上可聚為7類。結(jié)論：通過本研究明確了現(xiàn)有淮南豬良種資源的親緣關(guān)系，為有效保護和高效開發(fā)利用提供了分子生物學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：淮南豬；微衛(wèi)星標(biāo)記；親緣關(guān)系；遺傳多樣性；

    淮南豬，又名淮南黑豬、歷史悠久，是河南省著名的地方優(yōu)良品種之一，也是“我國少有的地方優(yōu)良品種之一”，屬華北類型，具有性成熟早，耐粗飼、適應(yīng)性強、遺傳性能穩(wěn)定、肉質(zhì)鮮嫩，色澤鮮艷等優(yōu)良特性^[1]?；茨县i主要產(chǎn)區(qū)位于河南省東南部，2004年新縣通過了國家淮南豬原產(chǎn)地標(biāo)記注冊。近年來，由于受到一些外來品種的影響和盲目雜交，純種淮南豬飼養(yǎng)量逐年減少，品種純度及遺傳多樣性在一定程度上受到威脅。因此，對淮南豬遺傳多樣性進行研究，評估其遺傳多樣性現(xiàn)狀, 并據(jù)此及時采取有效措施，對于保護和高效利用淮南豬資源具有重要的意義和實際意義。微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記技術(shù)是一種已發(fā)展成熟的分子生物學(xué)研究工具，與其它分子標(biāo)記技術(shù)，如RFLP、RAI D、SNP等相比較，該技術(shù)具有很多優(yōu)越性，如廣泛分布于各種真核生物基因組中并呈隨機分布，呈共顯性遺傳并遵循孟德爾遺傳規(guī)律，具有豐富的多態(tài)性，相對保守性，容易檢測，受內(nèi)外環(huán)境因素影響小，遺傳穩(wěn)定等，是目前應(yīng)用較為廣泛的一種DNA分子標(biāo)記^{[2, 3]}。本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，對目前淮南豬繁育群體基因組DNA 的多態(tài)性進行比較分析，研究遺傳多樣性的現(xiàn)狀，明確其遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，為有效保護和高效開發(fā)利用河南省現(xiàn)有地方優(yōu)良豬種資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品采集 試驗用淮南豬（公，24頭）來自新縣境內(nèi)不同繁育種群。采用5mL一次性真空血液采集管 (EDTA抗凝)，前腔靜脈采血，每頭5mL左右，血樣冷藏運回實驗室，-20℃冷凍保存。

1.1.2儀器設(shè)備

常壓電泳儀、4℃、－20℃冰箱、低溫高速離心機、水浴鍋、分析天平、pH計、PCR儀等。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA提取  采用基因組DNA快速提取試劑盒（天根生物科技有限公司）從血液樣品中快速提取DNA，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.2.2微衛(wèi)星標(biāo)記位點   利用21個分布于豬主要染色體上的微衛(wèi)星位點檢測取樣公豬的遺傳多樣性，各微衛(wèi)星位點的染色體位置、等位基因數(shù)、引物序列及熒光標(biāo)記、Tm值見表1。

1.2.3  PCR擴增的體系   采用 10 μL 反應(yīng)體系，具體反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性5min，30循環(huán)（95℃ 30s; 退火30s; 72℃1min），72℃終末延伸5min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的檢測  采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增效率，銀染法顯色、拍照保存。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析                 

利用Cervus軟件分析微衛(wèi)星各位點的等位基因頻率；應(yīng)用NTSYSpc2.1 遺傳分析軟件對21對引物進行分析，獲得遺傳相似系數(shù)，根據(jù)相似系數(shù)UPGMA 法對試驗動物進行了聚類分析。

表1　微衛(wèi)星位點的染色體位置、等位基因數(shù)及引物序列

Table1 Microsatellite loci in the chromosome location, the number of alleles and primer sequences

座位 Loci	染色體 Chormosome	等位基因大小（bp） Allele size	引物序列(5’- 3’) The sequence of primers	退火溫度/℃ Annealing temperature
S0155	1q	150-166	TGTTCTCTGTTTCTCCTCTGTTTG GTTAAAGTGGAAAGAGTCAATGGCTAT	55
CGA	1q	250-320	ATAGACATTATGTAAGTTGCTGAT GAACTTTCACATCCCTAAGGTCGT	55
SW240	2P	96-115	AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA	55
SW72	3P	100-116	ATCAGAACAGTGCGCCGT GTTTGAAAATGGGGTGTTTCC	55
SW902	3q	195-214	ATCAGTTGGAAATGATGGCC CTTGCCTCAAAGAGTTGTAAGG	55
S0227	4P	231-256	GATCCATTTATAATTTTAGCACAAAGT GCATGGTGTGATGCTATGTCAAGC	55
S0005	5q	205-248	TCCTTCCCTCCTGGTAACTA GCACTTCCTGATTCTGGGTA	55
S0228	6q	222-249	GGCATAGGCTGGCAGCAACA GTTCCGCCCTCACAGACCCAAAT	55
S0101	7q	197-216	GAATGCAAAGAGTTCAGTGTAGG GTCTCCCTCACACTTACCGCAG	55
S0225	8	170-196	GCTAATGCCAGAGAAATGCAGA CAGGTGGAAAGAATGGAATGAA	55
SW911	9p	153-177	CTCAGTTCTTTGGGACTGAACC CATCTGTGGAAAAAAAAAGCC	55
SW951	10q	125-133	TTTCACAACTCTGGCACCAG GATCGTGCCCAAATGGAC	55
S0386	11q	156-174	GAACTCCTGGGTCTTATTTTCTA GTCAAAAATCTTTTTATCTCCAACAGTAT	55
S0090	12q	244-251	CCAAGACTGCCTTGTAGGTGAATA GCTATCAAGTATTGTACCATTAGG	55
SW769	13	106-140	GGTATGACCAAAAGTCCTGGG TCTGCTATGTGGGAAGAATGC	55
SW857	14	144-160	TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC GATCCTCCTCCAAATCCCAT	55
S0355	15	243-277	TCTGGCTCCTACACTCCTTCTTGATG GTTTGGGTGGGTGCTGAAAAATAGGA	55
SW742	16	193-224	AATTCTACTTCTGGGGAGAGGG CTTTTGGGAACATTTCTGCC	55
SW24	17	96-121	CTTTGGGTGGAGTGTGTGC ATCCAAATGCTGCAAGCG	55
SW1023	18	84-117	AACCTGCTGAGCCACAGTG GCAAGTACCCAATCTTTTTTCC	53
S0218	X	164-184	GTGTAGGCTGGCGGTTGT CCCTGAACCCTAAAGCAAAG	55

 

2 結(jié)果與分析

2.1微衛(wèi)星引物擴增結(jié)果

利用21對微衛(wèi)星引物對淮南豬基因組DNA 模板進行了PCR擴增；部分微衛(wèi)星座位PCR 擴增產(chǎn)物的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1。從凝膠電泳圖譜我們可以看出，所測位點的多態(tài)性較好，條帶清晰易辯，雜帶少，說明所提DNA質(zhì)量高，擴增和染色時間掌控好。21個微衛(wèi)星座位的等位基因大小、染色體位置、等位基因數(shù)、引物序列等見表 1。

 

圖1  淮南公豬PCR擴增產(chǎn)物變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

Fig1 Polyacrylamide gel electrophoresis results of genomic DNA of Huainan boars

 

2.2淮南豬群體遺傳變異

24頭淮南公豬個體中共檢測到93個等位基因，21個微衛(wèi)星座位各等位基因大小、基因頻率見表2。

表 2  各個位點等位基因大小及基因頻率

Table 2 Gene frequency and the size of all loci alleles

 

2.3淮南豬個體間親緣關(guān)系

運用NT system對24頭淮南公豬個體間的親緣關(guān)系進行了聚類分析，分享結(jié)果見圖2。根據(jù)圖2可以將淮南公豬劃分7個類型：XHN-3、XNH-3、XHN-29、8M-2聚為一類；XHN-4、XHN-11、XHN-6、XHN-10、XHN-7、XHN-19、XHN-26、XHN-30、XHN-17、XHN-23聚為一類；XHN-13、XHN-20、XHN-28、XHN-31聚為一類；XHN-14、XHN-22聚為一類；XHN-21單獨聚為一類；XHN-24、SN-29聚為一類；XHN-32單獨聚為一類。

圖2 淮南公豬個體間聚類結(jié)果

Fig 2 Clustering result for the individuals of Huainan boars

3 討論

在加快淮南豬高效開發(fā)與利用過程的任何階段中，其選種選配都要結(jié)合個體間的親緣關(guān)系，根據(jù)本研究結(jié)果可初步確定被檢公豬之間的個體親緣關(guān)系、遺傳結(jié)構(gòu)等，本研究為進一步加快高效開發(fā)與利用地方良種資源提供了有效的理論依據(jù)。

微衛(wèi)星又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列或簡單重復(fù)序列，是均勻分布與真核生物基因組中的序列，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用非常廣泛應(yīng)用^[4-6]。不同個體在同一微衛(wèi)星座位上的等位基因數(shù)目和頻率的差異能夠體現(xiàn)出其遺傳上的差異, 并可借此來確定個體間的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)^{[7, 8]}。在微衛(wèi)星應(yīng)用研究中，Zeveren等運用微衛(wèi)星7個座位對比利時4個豬種進行了研究，通過多肽信息含量、有效等位基因數(shù)、等位基因頻率等分析了各個品種遺傳多樣性^[9]。Li等利用微衛(wèi)星20個座位對我國10個地方種豬進行了遺傳多樣性分析^[10]。SanCristobal等^[11]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對歐洲豬種進行了遺傳多樣性分析。眾多研究表明，在世界各地的豬群中都有較好的多態(tài)性，其中14個微衛(wèi)星位點：S0155、SW240、SW72、S0227、S0005、S0228、S0101、S0355、SW911、SW951、S0386、S0090、SW769、SW857、SW24，已被用來進行奧地利豬群（長白、皮特蘭和大白豬）的親緣關(guān)系鑒定，結(jié)果的可靠性在99%以上^[12]。本研究采用了21個微衛(wèi)星標(biāo)記，檢測了不同來源且具有代表性的不同淮南公豬個體間在DNA 水平上的變異，并估測了不同個體間的遺傳距離，因此本研究具有很高的可信度，更能準(zhǔn)確地反應(yīng)其當(dāng)前遺傳多樣性的現(xiàn)狀。

淮南豬具有耐寒、耐熱、耐粗飼、抗病性能好、肉質(zhì)性狀優(yōu)異，曾是地方農(nóng)民飼養(yǎng)的當(dāng)家豬種。自20世紀(jì)80代末以來，隨著外來瘦肉型豬種的大量引進，尤其是外來公豬不斷被引進，由于盲目雜交導(dǎo)致純種淮南豬飼養(yǎng)量急速下降。本試驗通過檢測現(xiàn)有淮南公豬衛(wèi)星位點的基因,初步分析被檢測個體之間的親緣關(guān)系和群體遺傳結(jié)構(gòu)，這為有效地保護和利用現(xiàn)有地方良種資源，挖掘優(yōu)異基因為育種工作和生產(chǎn)服務(wù)提供了有效的分子水平的理論依據(jù)。

 

參考文獻:

 

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Sudies on Geneitc Relationships among Huainan boars GermPlasm

 

ZHANG Jia-qing¹, WANG Jing¹, CHEN Jun-feng¹, REN Qiao-ling¹, XIONG shao-wei², XING Bao-song1^*

 

 (1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450008, China; 2. Henan Xing Rui agricultural and animal husbandry technology Co., LTD. Xinyang 465550, China )

 

Abstract: It is of great theoretical and practical significance to study the genetic relationships among Huainan pigs for potentializing gene resources and serving the bereding. In this study, the genetic variability within Huainan boars in Henan Province were surveyed by means of 21 microsatellite loci recommended by ISAG (the International Society for Animal Genetics) and FAO (Food and Agriculture Organization). The number of alleles，allele frequency，genetic relationship，genetic distances and so on among these boars were calculated. Totally 93 alletes were found, and the number were ranged from 3 to 8 for each locus. The average number of alleles was 4.43. The genetic relationship among the individuals was clear. The cluster analysis for  24 boars was carried out with NTSYSpc2.1 software and the 24 boars could be divided into 7 categories at coefficient value of 0.748. In conclusion, this study clarified the genetic relationship among Huainan boars and provided molecular basis for potentializing gene resources and serving the bereding.

Key words: Huainan pig; Microsatellite markers; Genetic relationship; Genetic diversity